細(xì)胞復(fù)蘇

       細(xì)胞復(fù)蘇是將保存在液氮或-80℃冰箱中的細(xì)胞株解凍并重新培養(yǎng)的過程。細(xì)胞復(fù)蘇的關(guān)鍵是快速。防止在解凍過程中，產(chǎn)生的水珠形成冰晶損傷細(xì)胞。細(xì)胞復(fù)蘇一般步驟如下：

       1. 預(yù)先加熱水浴鍋，溫度至 37-40℃，并在離心管中準(zhǔn)備好 10mL 培養(yǎng)基

       2. 從液氮罐或冰箱中取出細(xì)胞，迅速放進(jìn)預(yù)熱的水浴鍋中，鑷子夾住凍存管晃動，使其受熱均勻

       3. 當(dāng)凍存管內(nèi)*融化時，注意用酒精擦拭凍存管消毒，將液體倒入含有 10mL 培養(yǎng)基的離心管中

       4. 離心 5min，去除上清，得到沉淀

       5. 用培養(yǎng)基懸浮沉淀，并接種到培養(yǎng)瓶常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

       細(xì)胞復(fù)蘇后，生長一段時間，95%的細(xì)胞貼壁生長，細(xì)胞狀態(tài)良好，說明細(xì)胞復(fù)蘇成功。

       

       瞬轉(zhuǎn)步驟

       以 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑為例的操作流程，不同轉(zhuǎn)染試劑參考說明書

       1. 將復(fù)蘇后常規(guī)培養(yǎng)的細(xì)胞按照 1-3x105 接種到 6 孔板中，加入 2-4mL 的*培養(yǎng)基，混勻放置在氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃過夜

       2. 無菌狀態(tài)下配置如下溶液：

       a 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 2ug 的待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒

       b 用 100ul 的無血清培養(yǎng)基稀釋 25ul 的 Lipofectamine 轉(zhuǎn)染試劑（血清的存在會影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，因此要使用無血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染）

       3. 將 ab 溶液混合并搖勻，室溫下放置 30min 左右

       4. 細(xì)胞培養(yǎng)至 80%單層左右，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞 2 次，每孔加入 1mL 的無血清培養(yǎng)基，并將混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔，按十字方向輕搖混勻，氣套式二氧化碳培養(yǎng)箱中 37℃培養(yǎng) 24 小時

       5. 將轉(zhuǎn)染液倒出，換為*培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng) 3-4 天后檢測蛋白表達(dá)量

       轉(zhuǎn)染檢測

       收集培養(yǎng)的細(xì)胞，采用超聲或酶解的方法破碎細(xì)胞，離心得到上清。轉(zhuǎn)染后的檢測主要包括基因水平和蛋白水平的檢測。針對基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 進(jìn)行驗(yàn)證，或可使用先達(dá)基因ERA法進(jìn)行檢測，簡單，快速，準(zhǔn)確。蛋白水平，使用 western blot 檢測。