時(shí)間分辯熒光分析法

1 ）銪熒光檢測法

標(biāo)記靶細(xì)胞

1． EuCl3 的制備：稱取 58.08mg Eu2 O3 ，用少量 1N HCl 攪拌至溶解，再用 1N NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 4.0 。加雙蒸水配成 33 ～ 100mmol/L 的保存液， 4 ℃保存?zhèn)溆谩?br />2． 用預(yù)冷的標(biāo)記液將靶細(xì)胞濃度調(diào)整到 5 × 106 /ml ，加 50 μ l 10mg/ml 硫酸葡聚糖，置冰浴中 20 分鐘，其間搖晃數(shù)次。
3． 加入 30 μ l 100mmol/L CaCl2 溶液終止反應(yīng) 5 分鐘。
4． 用含 2mmol/L CaCl2 的 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 5 次。用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將靶細(xì)胞配成 5 × 104 /ml 。

檢測方法

1． 在 96 孔圓底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入靶細(xì)胞懸液，每孔加 100 μ l 。
2． 向各孔加 100 μ l 效應(yīng)細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例根據(jù)要求而定，通常為 5 ： 1 ～ 20 ： 1 。自然釋放孔不加效應(yīng)細(xì)胞只加 100 μ l 培養(yǎng)液，最大釋放孔中加 100 μ l 0.5 ％ Triton X-100 。每個(gè)實(shí)驗(yàn)置三個(gè)復(fù)孔。
3． 置 37 ℃ 5 ％ CO2 的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 小時(shí)。
4． 從每孔吸出 20 μ l 上清液，對應(yīng)加入另一塊 96 孔酶標(biāo)板中，向第二塊板每孔加 200 μ l 增強(qiáng)液。室溫中混合 5 分鐘。在時(shí)間分辯熒光分析儀上測定各孔的熒光強(qiáng)度。同時(shí)做 EuCl3 的標(biāo)準(zhǔn)曲線：用 0.05mol/L pH7.0 檸檬酸緩沖液配制 10 倍梯度
5． 特異性殺傷活性計(jì)算： 殺傷活性（％）＝ [ （實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度－自然釋放組熒光強(qiáng)度） / （最大釋放組熒光強(qiáng)度－自然釋放組熒光強(qiáng)度） ] × 100 ％

2 ）用時(shí)間分辯熒光檢測法同時(shí)檢測 NK 細(xì)胞對三種靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性

標(biāo)記靶細(xì)胞

1． 取 107 靶細(xì)胞，用洗滌液（含 93mmol/L NaCl, 5mmol/L KCl 和 2mmol/L MgCl2 的 50mmol/L pH7.4 Hepes ，雙蒸水配制）洗滌一次。小心吸去上清液，用 1ml 標(biāo)記液（洗滌液中加 0.5mg/ml 磷酸葡聚糖和 0.06mmol/L Eu3+ 或 2mmol/L Sm3+ 或 0.2mol/L Tb3+ ，以及比鑭系離子濃度高 5 倍的 DTPA ）懸浮細(xì)胞。將細(xì)胞懸液置冰上 20 分鐘，每 3 分鐘上下吹打 1 次。
2． 加入 2ml 終止液（洗滌液中加 2mmol/L CaCl2 和 10mmol/L 葡萄糖），終止標(biāo)記反應(yīng)并使細(xì)胞膜上的孔隙封閉。 5 分鐘后用終止液洗滌 3 次，用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌 3 次，每次洗滌時(shí)離心 500 × g 10 分鐘。
3． 用細(xì)胞培養(yǎng)液將細(xì)胞配成 1.2 × 105 /ml 或 5 × 104 /ml 備用。